細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)如何進(jìn)行支原體污染的檢測(cè)

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，支原體污染的檢測(cè)至關(guān)重要，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。以下是支原體污染檢測(cè)的主要方法和步驟：

1.相差顯微鏡檢測(cè)

原理：支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。

步驟：

將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的蓋玻片上。

24小時(shí)后取出，用相差油鏡觀察。

2.熒光染色法

原理：利用熒光染料使支原體DNA著色，通過(guò)熒光顯微鏡觀察。

熒光染劑Hoechst 33258檢測(cè)支原體污染的原理：染色劑會(huì)結(jié)合到DNA A-T富含區(qū)域，支原體A-T含量較高（55％~80％），因此可將其染色而檢測(cè)。

步驟：

制備標(biāo)本：在六孔板中制備蓋玻片細(xì)胞培養(yǎng)物，接種待測(cè)細(xì)胞，培養(yǎng)1～2天。

固定：用新鮮配制的1：3冰醋酸/甲醇固定液固定15分鐘，重復(fù)固定一次，然后干燥。

染色：用Hoechst 33258熒光染液染色30分鐘，避光操作。

洗滌：用雙蒸水浸泡染色過(guò)的蓋玻片3次，每次3～5分鐘。

封片：滴加含50％甘油的檸檬酸緩沖液到染色過(guò)的細(xì)胞表面，然后封片。

觀察：在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光分布狀態(tài)，判斷有無(wú)支原體污染及污染程度。

3.PCR法檢測(cè)支原體

原理：基于酶促DNA合成反應(yīng)，擴(kuò)增支原體DNA，檢測(cè)其存在。

步驟：

提取標(biāo)本DNA（如酚氯仿法）。

使用特定引物和DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

通過(guò)凝膠電泳或其他方法檢測(cè)PCR產(chǎn)物，確認(rèn)支原體污染。

4.掃描電子顯微鏡法

原理：利用掃描電子顯微鏡直接觀察支原體。

特點(diǎn)：直觀、準(zhǔn)確，但操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，常作為最后定性檢測(cè)。

5.DNA分子雜交檢測(cè)或支原體培養(yǎng)等方法

這些方法也可以用于檢測(cè)支原體污染，但具體步驟和原理因方法而異。

注意事項(xiàng)

在進(jìn)行支原體污染檢測(cè)時(shí)，應(yīng)使用無(wú)菌技術(shù)和適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施，以避免交叉污染。

選擇合適的檢測(cè)方法和步驟，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和條件進(jìn)行選擇。

對(duì)于疑似支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)及時(shí)采取措施進(jìn)行處理，以避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不良影響。