從HiFi測(cè)序角度解惑細(xì)胞與基因治療的神話

細(xì)胞和基因治療研究對(duì)生物制藥開(kāi)發(fā)至關(guān)重要，HiFi長(zhǎng)讀測(cè)序在整個(gè)過(guò)程中顯著增強(qiáng)了許多測(cè)序應(yīng)用。盡管AAV測(cè)序是基因組學(xué)的最新應(yīng)用之一，但它也是當(dāng)今疾病研究中最有前途的應(yīng)用之一。腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus, AAV)是在基因治療載體上實(shí)驗(yàn)最活躍的病毒之一使用AAV的基因療法和CAR-T等細(xì)胞療法有可能治愈以前無(wú)法治愈的疾病。尤其是CAR-T細(xì)胞癌癥治療，在對(duì)抗這種毀滅性疾病方面顯示出巨大的希望。2023年，FDA批準(zhǔn)了幾種新的基于AAV的療法和基于細(xì)胞的基因療法，用于治療杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、嚴(yán)重血友病A和鐮狀細(xì)胞病。

AAV載體的設(shè)計(jì)對(duì)基因治療研究產(chǎn)生了影響，這可能是對(duì)抗這些疾病的最后一站，也許還有更多。高度精確的長(zhǎng)讀測(cè)序支持研究設(shè)計(jì)、驗(yàn)證和優(yōu)化使用這種病毒載體的潛在基因療法。

載體設(shè)計(jì)在基因治療開(kāi)發(fā)的成功中起著至關(guān)重要的作用。在細(xì)胞和基因治療中，安全性是最重要的，研發(fā)過(guò)程也非常漫長(zhǎng)，意想不到的錯(cuò)誤可能會(huì)迅速破壞多年的工作，可能會(huì)推遲那些需要挽救生命的治療。全面準(zhǔn)確地描述AAV產(chǎn)品的特征可以降低臨床試驗(yàn)中代價(jià)高昂的失敗風(fēng)險(xiǎn)。

全面了解靶標(biāo)編輯和脫靶編輯、載體或構(gòu)建體整合以及插入突變是驗(yàn)證AAV產(chǎn)品設(shè)計(jì)和確保其可制造性的關(guān)鍵組成部分。使用特殊的精度和長(zhǎng)度的HiFi讀數(shù)意味著你可以對(duì)你的產(chǎn)品設(shè)計(jì)充滿信心，避免意外的支線。

高保真閱讀器對(duì)組裝基因組很有好處，這是真的，但它們能做的遠(yuǎn)不止這些。

細(xì)胞計(jì)數(shù)和基因治療研究是HiFi測(cè)序的眾多應(yīng)用之一。無(wú)論是全長(zhǎng)AAV測(cè)序，基因編輯評(píng)估，質(zhì)?；驍U(kuò)增子庫(kù)篩選，還是載體整合，>20 kb reads和99.9%準(zhǔn)確率的HiFi的成功組合都可以讓您檢測(cè)短讀測(cè)序可能錯(cuò)過(guò)的變體或事件。

你可以在AAV基因治療發(fā)展的每個(gè)研究階段使用HiFi測(cè)序:發(fā)現(xiàn)AAV載體:通過(guò)靶向測(cè)序發(fā)現(xiàn)新的衣殼。優(yōu)化AAV載體設(shè)計(jì):通過(guò)觀察截?cái)?、碎片和其他非全長(zhǎng)異常的頻率來(lái)改進(jìn)設(shè)計(jì)。

確認(rèn)mRNA轉(zhuǎn)錄本:通過(guò)全長(zhǎng)同種異構(gòu)體測(cè)序量化同種異構(gòu)體。

研究宿主整合:了解這些事件的頻率，以確保產(chǎn)品的潛在安全性和有效性?確保AAV生產(chǎn)的質(zhì)量比較載體和未解析的基因組，并評(píng)估由不同平臺(tái)制作的載體準(zhǔn)備

那么基因編輯呢?HiFi測(cè)序可以通過(guò)以下方式為你的基因編輯研究提供動(dòng)力:評(píng)估基因插入CRISPR目標(biāo)位點(diǎn)導(dǎo)致的indel和其他突變?檢測(cè)罕見(jiàn)的脫靶突變。了解在等位基因特異性Cas9切割的情況下單倍型和SNVs對(duì)基因編輯的影響?通過(guò)使用無(wú)擴(kuò)增方法避免PCR偏差和局限性

3:準(zhǔn)確性對(duì)于表征AAV雜質(zhì)并不那么重要，比如部分基因組。

在所有科學(xué)領(lǐng)域，準(zhǔn)確性都是至關(guān)重要的，在細(xì)胞和基因治療研究中，這種風(fēng)險(xiǎn)可以說(shuō)更高，因?yàn)榕R床試驗(yàn)、患者結(jié)果和改變生活的治療方法都處于危險(xiǎn)之中。

借助高精度的HiFi長(zhǎng)讀數(shù)，您可以評(píng)估AAV中的雜質(zhì)，如部分基因組，同時(shí)獲得有關(guān)序列一致性的關(guān)鍵信息。PacBio HiFi測(cè)序?qū)㈤L(zhǎng)讀數(shù)的優(yōu)勢(shì)與桑格水平的準(zhǔn)確性結(jié)合起來(lái)。這意味著您可以使用一種技術(shù)來(lái)監(jiān)控和改進(jìn)AAV的發(fā)現(xiàn)和制造，降低成本高昂的故障風(fēng)險(xiǎn)，從而將開(kāi)發(fā)時(shí)間表推遲數(shù)月甚至數(shù)年。

缺少關(guān)于矢量質(zhì)量的關(guān)鍵信息可能會(huì)影響設(shè)計(jì)的有效性。

4:配對(duì)納米孔與是最簡(jiǎn)單的方法來(lái)表征AAV從倒置串聯(lián)重復(fù)序列(ITR)到ITR。

事實(shí):這種說(shuō)法是短視的。

ONT和short-reads都不能完全解析ITRs，使用short-reads時(shí)需要額外的生物信息學(xué)比對(duì)工作。當(dāng)你能做得更好的時(shí)候，為什么要進(jìn)行多次分析?高度精確的長(zhǎng)讀測(cè)序結(jié)合了準(zhǔn)確度和閱讀長(zhǎng)度，你需要在一個(gè)實(shí)驗(yàn)。永遠(yuǎn)不要再因?yàn)榫_度太低或太短而無(wú)法對(duì)齊而丟棄讀取。此外，具有HiFi讀數(shù)的長(zhǎng)讀段測(cè)序支持廣泛的應(yīng)用，這些應(yīng)用對(duì)細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)至關(guān)重要，包括:AAV測(cè)序、基于擴(kuò)增子的構(gòu)建篩選、基因編輯和靶向和脫靶評(píng)估、全長(zhǎng)質(zhì)粒測(cè)序、載體整合、RNA測(cè)序和全基因組測(cè)序。

5:AAV復(fù)雜到難以使用PacBio HiFi測(cè)序。

事實(shí):這種說(shuō)法不正確。

PacBio和Form Bio的合作伙伴為AAV測(cè)序和數(shù)據(jù)分析提供端到端的工作流程，在一個(gè)一體化的解決方案中優(yōu)化您的AAV載體設(shè)計(jì)。該工作流程適用于使用相同協(xié)議的ssAAV和scAAV測(cè)序。Form Bio工作流程經(jīng)過(guò)PacBio認(rèn)證兼容，并提供分析軟件來(lái)幫助您分析和可視化AAV數(shù)據(jù)，從而節(jié)省時(shí)間和資源。