分享細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存流程

細(xì)胞培養(yǎng)大致可以分為三個(gè)步驟，細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存。今天小編就跟大家分享一下細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存的操作流程。

細(xì)胞復(fù)蘇

液氮中取出的細(xì)胞，待液氮揮發(fā)后，馬上將細(xì)胞凍存管置于37℃水浴中輕輕搖動(dòng)使快速融化（盡量控制在2min內(nèi)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)了可能會(huì)影響細(xì)胞的狀態(tài)）。在解凍時(shí)，凍存管瓶口盡量控制在水面以上。

解凍后，將凍存管轉(zhuǎn)移到無(wú)菌操作臺(tái)，75%酒精擦拭凍存管外部。

將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至，裝有37℃預(yù)熱的培養(yǎng)基離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘，棄上清。

重新加入經(jīng)預(yù)熱培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以適宜密度，一般約為(3~5)×10^5個(gè)/ml密度接種到培養(yǎng)器皿（直徑10cm）中。放到37℃孵育，第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況。

細(xì)胞傳代

用移液器吸取并丟棄使用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導(dǎo)致易污染），并用PBS緩慢沖洗細(xì)胞2次。

以直徑10cm的培養(yǎng)皿為例，向培養(yǎng)皿中加入500μl胰蛋白酶-EDTA（根據(jù)各細(xì)胞的使用說(shuō)明，選擇合適的濃度）消化液，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，放到37 ℃ 孵育（一般2分鐘左右即可）。鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，傾斜培養(yǎng)瓶時(shí)細(xì)胞層能自然流即可終止，此時(shí)應(yīng)加入2-3ml含血清的完全培養(yǎng)液終止消化（細(xì)胞的解離時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)可能偏差，根據(jù)細(xì)胞來(lái)源確定，有些細(xì)胞屬于半貼壁，無(wú)需胰蛋白酶也可解離）。

吸取所有培養(yǎng)皿內(nèi)的液體，沿培養(yǎng)皿底部緩慢吹打，重復(fù)該動(dòng)作2-3次，使所有細(xì)胞沿瓶底流下，再輕柔地把細(xì)胞吹打成單個(gè)懸液（吹打過(guò)程中應(yīng)盡量避免氣泡的產(chǎn)生）。

把所有的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后棄上清。

加入培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞懸液。按實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞量添加到新的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿37 ℃ 孵育，每天觀察細(xì)胞的貼壁情況。

注意：向培養(yǎng)皿加液體時(shí)，建議從與貼壁細(xì)胞層相對(duì)的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動(dòng)細(xì)胞層，前后搖晃容器數(shù)次，最后移棄沖洗液。若是懸浮細(xì)胞傳代培養(yǎng)，過(guò)程中省消化步驟。

細(xì)胞凍存

按照“細(xì)胞傳代”中的步驟收集細(xì)胞。

加入細(xì)胞凍存液（一般10%DMSO+對(duì)應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基），重懸細(xì)胞，使細(xì)胞的終密度為(5~10)程序降溫，更推薦使用程序降溫盒。若手動(dòng)進(jìn)行降溫，凍存的一般程序?yàn)榻禍厮俣?～2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可將降溫速度增加至5℃～10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。

以上就是細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存的操作流程了，細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)選擇優(yōu)質(zhì)的胎牛血清，締一生物提供ausbian進(jìn)口特級(jí)胎牛血清，內(nèi)毒素低，多個(gè)批次供應(yīng)選擇。

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