細(xì)胞有小黑點(diǎn)生長(zhǎng)變慢，是細(xì)胞被支原體污染了嗎？

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)得慢的細(xì)胞總會(huì)出現(xiàn)黑點(diǎn)，還有一些有漂浮的死細(xì)胞，崩解之后形成黑點(diǎn)和碎片，但還有一些是霉菌或支原體污染也會(huì)形成小黑點(diǎn)，小黑點(diǎn)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)效果等都有影響，細(xì)胞有小黑點(diǎn)生長(zhǎng)變慢，是細(xì)胞被支原體污染了嗎？

小黑點(diǎn)之所以這么令人頭痛，是由于它的數(shù)量會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而不斷增加，當(dāng)數(shù)量多到一定程度的時(shí)候，就會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)造成一定的影響，嚴(yán)重影響科研的進(jìn)展。在顯微鏡下觀察時(shí)往往表現(xiàn)為沒(méi)有光澤，體積較小的黑色顆粒。

一、細(xì)胞碎片

化學(xué)或物理的強(qiáng)烈刺激（例如胰酶消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，吹打細(xì)胞太過(guò)用力等）往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，產(chǎn)生很多的細(xì)胞碎片。在顯微鏡下進(jìn)行觀察時(shí)，可以看到很多呈不規(guī)則形態(tài)、沒(méi)有光澤的顆粒粘附在細(xì)胞培養(yǎng)皿的底部。

建議：狀態(tài)不好的細(xì)胞往往貼壁能力較強(qiáng)，因此切勿用移液器進(jìn)行強(qiáng)力的吹打，從而損害了健康的細(xì)胞；另外，控制好胰酶消化的時(shí)間，只需要保證大部分正常的細(xì)胞被消化下來(lái)就可以了，然后更換新的細(xì)胞培養(yǎng)皿。

二、凋亡小體

體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞很容易受到培養(yǎng)環(huán)境因素的影響，例如營(yíng)養(yǎng)成分的改變、氧的供給、毒素、細(xì)胞代謝產(chǎn)物的積累、pH、 剪切力、細(xì)胞密度及微生物污染等。這些環(huán)境的改變都有可能誘發(fā)細(xì)胞的凋亡，從而產(chǎn)生很多分泌的凋亡小體。凋亡小體大多游離在培養(yǎng)基中，但也有一些會(huì)通過(guò)暴露的核酸彼此之間相互黏連，從而形成一個(gè)棕色的凋亡小體團(tuán)塊，沒(méi)有細(xì)胞光澤。

建議：細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中一定要控制細(xì)胞傳代的時(shí)間，不能讓細(xì)胞“長(zhǎng)過(guò)”；不要使用過(guò)酸或者過(guò)堿的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；選用內(nèi)毒素含量較低的血清。例如：選用Ausbian澳洲進(jìn)口特級(jí)胎牛血清，內(nèi)毒素含量≤3EU/ml，澳洲原裝進(jìn)口胎牛血清。

三、血清中的沉淀

磷酸鈣是常見(jiàn)的一種沉淀物，通常會(huì)使血清出現(xiàn)渾濁，并且在37℃培養(yǎng)的時(shí)候會(huì)增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點(diǎn)，這些小黑點(diǎn)由于布朗運(yùn)動(dòng)看上去可以活動(dòng)，因此經(jīng)常被誤認(rèn)為是微生物污染。

建議：經(jīng)過(guò)熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多，對(duì)于大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要進(jìn)過(guò)高溫滅活處理的。例如：選用Ausbian澳洲進(jìn)口特級(jí)胎牛血清，內(nèi)毒素含量≤3EU/ml，澳洲原裝進(jìn)口胎牛血清。

四、黑膠蟲(chóng)

對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的小黑點(diǎn)到底是什么，目前呼聲最高的非黑膠蟲(chóng)莫屬，但是小編查看了很多的資料，依舊不知道其為何方神圣。有人認(rèn)為是從血清中來(lái)的一種原蟲(chóng)，有人認(rèn)為是細(xì)菌，或是真菌，也有人認(rèn)為是血清中的蛋白結(jié)晶，因此消滅黑膠蟲(chóng)的方式也是各式各樣。

建議：如果污染的細(xì)胞數(shù)量不是很多，建議直接丟棄，或者重新復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

五、支原體污染

一旦您在細(xì)胞培育的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有黑點(diǎn)生成，首先，要肉眼觀察培育基是否混濁，然后，在鏡下觀察培育細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)，黑點(diǎn)是否游動(dòng)。假如細(xì)胞被污染，微生物則會(huì)大量繁衍，培育基就會(huì)迅速變黃、變混濁。污染包含細(xì)菌污染、支原體污染等。

建議：使用專(zhuān)業(yè)的細(xì)胞支原體去除劑Zell Shield，可去除細(xì)胞中支原體污染。   

細(xì)胞支原體去除試劑Zell Shield使用方法：

（1）在每次使用Zell Shield?之前，細(xì)胞傳代時(shí)，先使用廠家推薦的“懸浮沖洗法”處理好細(xì)胞，再使用加了Zell Shield?的培養(yǎng)基養(yǎng)細(xì)胞，能達(dá)到更好的祛除支原體的效果（“懸浮沖洗法”的詳細(xì)步驟，見(jiàn)下文）。

（2）Zell Shield?常規(guī)為-18℃保存，建議使用前，先融化分裝，仍舊-18℃避光保存，使用時(shí)按需融化配置。避免反復(fù)凍融。

（3）Zell Shield?按1:100濃度可直接加入培養(yǎng)基。例如：500ml培養(yǎng)基中添加5ml Zell Shield?，50mL/瓶的Zell Shield?可供5L培養(yǎng)基使用。

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