支原體標(biāo)準(zhǔn)品在核酸法驗證中的應(yīng)用

支原體核酸法是通過檢測支原體的特異核酸序列，以確定細(xì)胞上清或生物制品中是否存在支原體污染的一種方法。由于它具有檢測時間短（只需3-4h）、操作便捷等特點，越來越受到生物制品企業(yè)的青睞。

支原體核酸法包括PCR和qPCR，可作為藥典規(guī)定的培養(yǎng)法或DNA染色法的替代方法，或與以上方法相互補充。事實上，早在2011年，就有動物疫苗廠家在2011年第5期的《廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)》上，報道了用德國Minerva Biolabs（簡稱MB）公司的支原體PCR試劑盒，用于檢測疫苗中是否存在支原體的污染，它可與培養(yǎng)法互為補充，共同用于生產(chǎn)，為生產(chǎn)提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

但支原體核酸法在用于放行檢測之前，需先進行方法驗證。歐洲藥典和日本藥典均要求核酸法需要在靈敏度、特異性和耐用性三個指標(biāo)方面達(dá)到要求。

例如，在靈敏度方面（又稱最低檢測限），要求核酸法替代培養(yǎng)法，則靈敏度需達(dá)到10CFU/ml；核酸法替代DNA染色法，則靈敏度需達(dá)到100CFU/ml。

在特異性方面，歐洲藥典和日本藥典要求，核酸法要識別指定的常見9種支原體，而不識別與支原體有近緣關(guān)系的菌屬，如丙酮丁醇梭菌、嗜酸乳桿菌和肺炎鏈球菌，也不識別其他細(xì)菌和哺乳動物DNA。

在耐用性方面，歐洲藥典要求檢測結(jié)果不受方法參數(shù)的小的偏差的影響，如濃度的變化（MgCl2、引物、dNTP）、提取步驟的細(xì)微差別等。實際上這是強調(diào)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，不受人為操作誤差的影響。這可通過3輪不同時間段內(nèi)的檢測來實現(xiàn)，每輪進行8次重復(fù)檢測，最后觀察結(jié)果有什么變化。

在進行方法驗證時，參比標(biāo)準(zhǔn)品是必不可少的。世界**微生物防控專家德國MB公司提供有一系列的支原體標(biāo)準(zhǔn)品和支原體DNA標(biāo)準(zhǔn)品，用于支原體核酸法的方法學(xué)驗證。

圖. MB公司提供的10CFUTM支原體套裝

MB提供的標(biāo)準(zhǔn)品有三類：一類是靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品，它同時也用于耐用性驗證。該標(biāo)準(zhǔn)品為凍干粉型的滅活支原體，這樣不會造成實驗室污染。原支原體來自英國NCTC菌種保藏中心，由于傳代次數(shù)低，也很少發(fā)生突變。支原體經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)定量，有10CFU/管和100CFU/管可選。使用時用1ml與待測樣本同樣的基質(zhì)液去溶解。之后進行支原體DNA抽提，再進行核酸法檢測。如結(jié)果陽性，則表明最低檢測限能達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。

MB公司第二類標(biāo)準(zhǔn)品為特異性驗證用標(biāo)準(zhǔn)品，它包括支原體基因組DNA以及細(xì)菌基因組DNA，種屬經(jīng)測序驗證。該標(biāo)準(zhǔn)品為10ng左右包裝，為凍干粉型。

第三類標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)過嚴(yán)格定量的支原體DNA標(biāo)準(zhǔn)品，每管支原體基因組DNA的量為1×108基因組拷貝，用于10倍梯度稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對核酸法（主要是qPCR）的檢測限進行精確定量，并可驗證標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)與Ct值的線性關(guān)系。

圖. 肺炎支原體DNA的定量。模板DNA的范圍為2X105-2個拷貝數(shù)基因組

值得指出的是，歐洲藥典和日本藥典均要求先進行支原體DNA抽提，再進行核酸法檢測。因此，方法驗證實際上包括了核酸法的這兩部分。

對于生物制品、細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)企業(yè)，在選用已經(jīng)過廠家全面驗證的支原體檢測試劑盒之外，還需自己按照待測樣本類型進行方法的適用性驗證。因為試劑盒的驗證并不能代替包括操作過程在內(nèi)的方法的適用性，操作、樣本基質(zhì)和儀器同樣會對核酸法的技術(shù)指標(biāo)產(chǎn)生不可忽視的影響。

如您對德國MB公司的支原體標(biāo)準(zhǔn)品或檢測試劑盒感興趣，歡迎聯(lián)系MB公司中國區(qū)總代理上海威正翔禹生物或北京締一生物科技有限公司。

具體信息如下：

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德國MB公司簡介：

德國MB公司，全稱Minerva Biolabs，是世界**的微生物污染控制公司，成立于1999年，總部位于德國柏林。MB公司具有ISO 9001和ISO 13485體系認(rèn)證。

公司創(chuàng)始人來自于全球聞名的羅伯特?科赫微生物研究所。

二十年來，MB公司專注于微生物污染檢測與清除，

特別是支原體和軍團菌的技術(shù)和產(chǎn)品，在世界上遙遙領(lǐng)先。

?自1999年起即研發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)和生物藥工業(yè)用QC檢測試劑

?配備生物安全二級實驗室

?GMP級潔凈車間生產(chǎn)

?世界**的支原體PCR檢測試劑供應(yīng)商

?IOM和PDA成員

?ISO 9001和ISO 13485認(rèn)證

注：IOM全稱Institute of Medicine

PDA全稱Parenteral Drug Association

2007年，上海威正翔禹生物科技有限公司作為MB公司的全國總代理，將支原體檢測防控的優(yōu)秀產(chǎn)品引入中國。十幾年來，不斷為中國生物研究實驗室，以及眾多生物制藥企業(yè)，提供了完整高效的支原體等微生物檢測及祛除解決方案。