活體單細(xì)胞成像揭示生物鐘發(fā)育過(guò)程

PLOS Biology 期刊在線(xiàn)發(fā)表了題為《斑馬魚(yú)生物鐘的活體單細(xì)胞成像》的研究論文。該研究由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)**創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、上海腦科學(xué)與類(lèi)腦研究中心、神經(jīng)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)軍研究組、何杰研究組與安徽醫(yī)科大學(xué)附屬**醫(yī)院教授李元海合作完成。該研究成功構(gòu)建了可以活體實(shí)時(shí)觀測(cè)斑馬魚(yú)單細(xì)胞節(jié)律的報(bào)告基因系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)研究了單細(xì)胞水平的生物鐘在發(fā)育過(guò)程中是如何建立的，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)光照在斑馬魚(yú)的單細(xì)胞生物鐘發(fā)育中的重要作用。

從單細(xì)胞生物到人，二十四小時(shí)晝夜節(jié)律（circadian rhythm）是極為普遍的生物學(xué)現(xiàn)象。生物的生理過(guò)程和行為通過(guò)生物節(jié)律與外界二十四小時(shí)光照周期同步。在分子水平上，脊椎動(dòng)物的晝夜節(jié)律主要是由核心鐘基因構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋回路產(chǎn)生的。在組織和器官水平上，晝夜節(jié)律由核心鐘和周邊組織的鐘組成。核心鐘被普遍認(rèn)為位于哺乳動(dòng)物的SCN或斑馬魚(yú)的松果體， 接受光信號(hào)的輸入，然后通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)或激素等把節(jié)律信號(hào)傳遞到周邊組織。在成年動(dòng)物體內(nèi)，絕大部分細(xì)胞都能在核心鐘的指揮下自主地產(chǎn)生節(jié)律基因的振蕩。然而，有研究表明在胚胎干細(xì)胞中，節(jié)律基因的振蕩是缺失的。這說(shuō)明生物鐘的振蕩是在發(fā)育過(guò)程中逐漸建立的，但是目前尚不清楚單個(gè)細(xì)胞的鐘是如何在發(fā)育過(guò)程中建立的。斑馬魚(yú)體外受精且全身透明，非常利于活體成像研究，因此被廣泛用于動(dòng)物發(fā)育研究中。很多研究表明光照對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的生物鐘發(fā)育起著非常重要的作用。但是，外界光刺激到底是啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)的節(jié)律振蕩，還是僅僅同步了各細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)存在的振蕩，一直存在著爭(zhēng)議。這些問(wèn)題只能通過(guò)單細(xì)胞生物鐘報(bào)告基因的活體成像解決。

該研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)**次成功構(gòu)建了可以活體實(shí)時(shí)觀測(cè)單細(xì)胞節(jié)律的斑馬魚(yú)模型(nr1d1：VNP)（圖A）。他們使用雙光子顯微鏡對(duì)該熒光魚(yú)系進(jìn)行了單細(xì)胞水平的發(fā)育時(shí)間點(diǎn)成像。在全腦水平，發(fā)現(xiàn)nr1d1：VNP報(bào)告基因的表達(dá)從松果體中的感光細(xì)胞開(kāi)始，然后擴(kuò)散到其它大腦區(qū)域（視頂蓋和小腦等）的細(xì)胞中（圖B，C）。通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)中nr1d1：VNP陽(yáng)性細(xì)胞的3D重構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)nr1d1：VNP陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在松果體腔周?chē)?，而在中部則密度較低（圖D）， 同時(shí)使用單細(xì)胞RNA-seq技術(shù)鎖定了大腦中表達(dá)nr1d1：VNP細(xì)胞的分子類(lèi)型（圖E）。通過(guò)對(duì)松果體進(jìn)行更高分辨率的成像，他們發(fā)現(xiàn)大部分的nr1d1：VNP陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)都呈現(xiàn)晝夜節(jié)律振蕩疊加在發(fā)育趨勢(shì)上的特征（圖F）。最為有趣的是，在光/暗（LD）周期下，不同細(xì)胞的nr1d1：VNP表達(dá)顯示出同步的晝夜節(jié)律振蕩。然而，在光刺激缺失的全暗（DD）環(huán)境下，細(xì)部中的nr1d1：VNP晝夜節(jié)律表達(dá)被顯著抑制，但其隨發(fā)育上升的趨勢(shì)不受影響（圖G）。這些研究結(jié)果表明，發(fā)育早期光刺激是啟動(dòng)核心鐘細(xì)胞內(nèi)的24小時(shí)周期節(jié)律振蕩的重要開(kāi)關(guān)。

在這項(xiàng)工作中，研究者**實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)胞水平下監(jiān)測(cè)斑馬魚(yú)幼魚(yú)中晝夜節(jié)律基因的表達(dá)， 揭示了細(xì)胞中的晝夜節(jié)律在發(fā)育過(guò)程中是如何被逐步建立起來(lái)的。這種新的nr1d1：VNP節(jié)律報(bào)告魚(yú)系在晝夜節(jié)律研究中將有廣泛的應(yīng)用，比如可以用于研究晝夜節(jié)律與體內(nèi)細(xì)胞周期之間的關(guān)系、可以對(duì)晝夜節(jié)律進(jìn)行細(xì)胞型特異性成像、用于篩選影響晝夜節(jié)律和睡眠的藥物等。