用于發(fā)酵乳制品中乳酸菌鑒別計(jì)數(shù)的新型顯色培養(yǎng)基

酸奶常采用發(fā)酵劑發(fā)酵。發(fā)酵劑中的常見(jiàn)菌為唾液鏈球菌嗜熱亞種和德氏乳桿菌保加利亞亞種。在過(guò)去30年中，酸奶作為益生菌的載體，獲得了越來(lái)越多的重視。

益生菌包括乳桿菌屬和雙歧桿菌屬成員。在歸屬到益生菌中的乳酸菌中，常用的是鼠李糖乳桿菌和干酪/副干酪乳桿菌。最低劑量為106-107CFU/g。

為保證產(chǎn)品品質(zhì)，常需鑒別和定量每種菌株。人們因此開(kāi)發(fā)了許多用于酸奶中選擇性乳酸菌和雙歧桿菌計(jì)數(shù)的瓊脂平板培養(yǎng)基和流程。它們大部分是非選擇乳酸菌培養(yǎng)基，有的加入了抗生素以提高選擇性。但大部分對(duì)乳酸菌內(nèi)部鑒別的能力都不強(qiáng)。又如在酸奶中，這些培養(yǎng)基很難對(duì)每種菌株進(jìn)行選擇性計(jì)數(shù)。到目前，只有少數(shù)國(guó)際驗(yàn)證的方法，可以對(duì)如下菌進(jìn)行計(jì)數(shù)：雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、檸檬酸發(fā)酵菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。但當(dāng)存在其他乳酸菌時(shí)，這些培養(yǎng)基的鑒別能力比較弱。

對(duì)于乳制品中副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌計(jì)數(shù)的參比培養(yǎng)基是含1μg/ml的萬(wàn)古霉素。根據(jù)ISO 7889:2003，發(fā)酵菌株保加利亞乳桿菌和嗜酸鏈球菌可在酸性的MRS培養(yǎng)基（pH 5.4±0.1）和M17培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)。然而，當(dāng)這些菌種都存在于一個(gè)樣本時(shí)，很難對(duì)它們進(jìn)行有效鑒別和計(jì)數(shù)。

有一種解決方案是開(kāi)發(fā)顯色培養(yǎng)基。以往顯色培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)完全忽視了乳酸菌和益生菌。2016年，法國(guó)科學(xué)家描述了一種方法，能對(duì)發(fā)酵乳中的乳酸菌進(jìn)行選擇性計(jì)數(shù)，同時(shí)鑒別鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌（見(jiàn)下面參考文獻(xiàn)1）。

在該研究中，法國(guó)科學(xué)家采用的所有乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均在-80℃MRS肉湯中保存，嗜熱鏈球菌在添加了5.3%DMSO的Elliker培養(yǎng)基中保存。復(fù)蘇后，乳桿菌在MRS肉湯中培養(yǎng)，嗜熱鏈球菌在含0.5%乳糖的M17肉湯中生長(zhǎng)。

文中培養(yǎng)基HiMedia有提供

在該研究中，研究者對(duì)發(fā)酵劑和標(biāo)準(zhǔn)菌株通過(guò)Biolog表型芯片進(jìn)行了酶活性的選擇和鑒定，發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶在嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌種有表達(dá)，而而在副干酪乳桿菌種沒(méi)有表達(dá)。β-葡萄糖苷酶裂解在一種副干酪乳桿菌中有表達(dá)，在另一種副干酪乳桿菌中沒(méi)有表達(dá)。鼠李糖乳桿菌則同時(shí)表達(dá)β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。

研究者采用了兩種顯色培養(yǎng)基。其中，M2顯色培養(yǎng)基采用了顯色底物X-gal，它可被β-半乳糖苷酶裂解，產(chǎn)生藍(lán)色菌落（對(duì)應(yīng)保加利亞乳桿菌）。在酸性pH值時(shí)，該菌落也可能呈現(xiàn)綠色。M1顯色培養(yǎng)基含兩種顯色底物，即Salmon-gal和X-glc，它們可分別被β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶裂解，產(chǎn)生粉色和青綠色。在37℃微需氧孵育條件下，鼠李糖乳桿菌同時(shí)表達(dá)這兩種酶，因而呈現(xiàn)藍(lán)色。嗜熱鏈球菌呈現(xiàn)品紅色。副干酪乳桿菌一種菌種呈現(xiàn)青綠色色，另一種呈現(xiàn)無(wú)色。

研究者采用M1顯色培養(yǎng)基44℃孵育（這時(shí)副干酪乳桿菌不生長(zhǎng)），對(duì)鼠李糖乳桿菌計(jì)數(shù)。采用含10g/L鼠李糖的M1顯色培養(yǎng)基對(duì)副干酪乳桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。事實(shí)上，在該培養(yǎng)基上，鼠李糖乳桿菌首先使用鼠李糖，而不表達(dá)β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，導(dǎo)致無(wú)色菌落。

值得一提的是，知名生產(chǎn)商HiMedia公司也提供有乳桿菌顯色培養(yǎng)基（貨號(hào)M2065），用于乳桿菌之間的鑒別。在培養(yǎng)基上嗜酸乳桿菌ATCC 4356(WDCM 00098)呈淡粉色-粉色，鼠李糖乳桿菌ATCC 9595呈現(xiàn)淡綠色，發(fā)酵乳桿菌ATCC 9338呈現(xiàn)黃色，胚牙乳桿菌ATCC 8014 (WDCM 00016)呈現(xiàn)淡綠色-綠色（光暈），乳酸乳球菌乳酸亞種ATCC 19435呈現(xiàn)淡綠色-綠色（光暈）。

HiMedia公司是國(guó)際知名微生物產(chǎn)品生產(chǎn)商，一直致力于微生物培養(yǎng)和鑒定產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)，并具有WHO-GMP認(rèn)證、ISO9001，ISO13485認(rèn)證，CE和FDA注冊(cè)登記。其產(chǎn)品已行銷全球140多個(gè)國(guó)家。

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參考文獻(xiàn)

Anna Galat, etc. Novel method based on chromogenic media for discrimination and selective enumeration of lactic acid bacteria in fermented milk products.Food Microbiology. 2016,55:86-94