微生物法測定維生素B12的方法學(xué)評(píng)估

微生物法測定維生素B12的方法學(xué)評(píng)估

在我國，微生物法測定食品中的維生素B12、葉酸、泛酸、煙酸、生物素是首選方法，因此在國民生計(jì)中起到重要作用。本文擬以維生素B12為例，從方法學(xué)的角度就微生物法的特點(diǎn)，作一文獻(xiàn)上的綜述。

1954年，微生物法測定乳品中的維生素B12**出現(xiàn)，是由英國國立奶業(yè)研究所、維生素B12的研究專家Margaret E. Gregory首先建立，她用該法測定來自不同動(dòng)物種屬的奶中的維生素B12的含量（1）。

微生物法測定乳品和食品中的維生素B12，在上世紀(jì)90年代引入我國。關(guān)于這一方法，已有多篇報(bào)道進(jìn)行了方法學(xué)上的探討。現(xiàn)總結(jié)如下：

（一）對(duì)微生物法的評(píng)估

上海市食品藥品檢驗(yàn)所蔣孟虹等人用微生物法測定了腸內(nèi)營養(yǎng)粉劑中的維生素B12 含量。她們認(rèn)為，高效液相色譜法僅適用于常量分析,維生素B12對(duì)色譜前處理要求高, 因此色譜很難滿足痕量測定的要求。但微生物法操作步驟較多, 一些因素可能影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，她們對(duì)影響因素進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

?測試菌液的透光率在60%～80%之間時(shí), 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合較好，過高過低均導(dǎo)致線性擬合差。

?當(dāng)測試菌液的加入量為50μL時(shí), 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合良好。過多易導(dǎo)致濁度過高而不成梯度。

?標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)的透光率在30%左右為**測定時(shí)間, 此時(shí)各濃度點(diǎn)的透光率差別較大, 可拉開梯度。

?維生素B12 在0.001～0.010 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

她們認(rèn)為，微生物法檢出限低、靈敏度高,測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠, 適用于微量維生素B12的含量測定, 值得經(jīng)常進(jìn)行維生素檢測的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用推廣（2）。

國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心的張玉杰等人提出：微生物法的好處是，測定的是維生素的生物活性含量，更具生物學(xué)意義。同時(shí)，微生物作為一種活試劑，具有自身的特異性和高度的靈敏性，使得測定結(jié)果更為準(zhǔn)確。微生物分析法測定VB12在國際上已有幾十年的歷史，只是在我國報(bào)導(dǎo)還不是很多。

他們采用微生物法對(duì)12個(gè)奶基嬰幼兒食品的VB12含量進(jìn)行了多次重復(fù)測定，發(fā)現(xiàn)相對(duì)誤差均在10%以內(nèi)，50%的樣品測定的誤差小于5%，回收率多在90-110%之間。因而該方法是可行的，結(jié)果也是準(zhǔn)確可靠的（3）。

廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院林耀文等人發(fā)現(xiàn)，微生物法測定含乳飲料中的維生素B12，重復(fù)性良好，線性相關(guān)系數(shù)大于0.99，平均回收率為91.20%～102.2%，檢出限為0.04ng/ml，具有簡便、快速、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。（5）

（二）微生物法的干擾因素和注意事項(xiàng)

國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心的張玉杰等人提出了幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：

**，有些細(xì)菌可以產(chǎn)生Vb12，因此所有玻璃器皿及用具都要嚴(yán)格清洗，嚴(yán)格滅菌。清洗后**放入250℃烘箱，加熱1-2小時(shí)。整個(gè)分析過程都要注意防止溶液過多地暴露于光線中。

第二，建議每個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)三個(gè)平行檢驗(yàn)管，減少誤差。所有檢驗(yàn)管滅菌后要迅速水冷卻，盡量避免顏色形成。冷卻速度要一樣。

第三，測定菌體濃度時(shí)，要等檢驗(yàn)管內(nèi)發(fā)育和繁殖過程完全停止后再進(jìn)行。（3）

湖北省宜昌市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所陳緒華等人觀察了測定培養(yǎng)基的不同品牌對(duì)維生素B12線性的影響。發(fā)現(xiàn)青島海博和北京陸橋的維生素B12測定培養(yǎng)基作出的線性結(jié)果不理想，主要是培養(yǎng)基所含的本底較高。而更換為BD的測定培養(yǎng)基后，所得的線性結(jié)果較理想。本底存在，會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)的促生長作用減弱（即吸光度沒有等量增加）。當(dāng)測定培養(yǎng)基中不含本底時(shí)，菌懸液以及培養(yǎng)時(shí)間的微弱變化只影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的生長量，不影響曲線的線性。（4）

據(jù)我們了解，目前BD的維生素B12測定培養(yǎng)基已停產(chǎn)，因此可選用國際知名的微生物生產(chǎn)商HiMedia的產(chǎn)品。

上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院王志偉等人強(qiáng)調(diào)，菌種的活力和純度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有非常大的影響，應(yīng)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行菌種純化（7）。

（三）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)微生物法的改進(jìn)

廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院吳環(huán)等人提出了幾個(gè)更簡便的操作技巧用于維生素B12的測定：一是試驗(yàn)體系的體積縮小。用1.2ｍlPP小管替代了傳統(tǒng)的試管進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液及樣品溶液的培養(yǎng)和測定；標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和樣品溶液的制備也在1.2mlPP小管中進(jìn)行，由此避免了大量玻璃器皿的使用，同時(shí)顯著降低了外部干擾；二是將試驗(yàn)菌株預(yù)先固定在96排管，利用甘油保護(hù)冷凍的菌種。具體操作為：將萊士曼氏乳酸桿菌凍干菌株活化后，接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，（36.0±1.0）℃培養(yǎng)18～24h，將增菌肉湯培養(yǎng)物3000r/min離心數(shù)次，棄去上清液，使用含有甘油的維生素B12測定培養(yǎng)基進(jìn)行適宜的稀釋后，將菌懸液加入1.2ｍlPP小管中，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｔ摲椒O大地縮短了試驗(yàn)周期，而且菌株活力穩(wěn)定，保證了試驗(yàn)的有效性。（6）

吳環(huán)等人進(jìn)一步將該方法推廣到嬰幼兒配方乳粉中的其他3種水溶性維生素（葉酸、生物素、肌醇）的測定，結(jié)果同樣有效。（8）

上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院王志偉等人對(duì)于天然燕麥的維生素B12的測定，加入了1%的 α-淀粉酶溶液，發(fā)現(xiàn)酶解溶液有助于提取維生素B12，降低樣品粘度，更方便測量，因此優(yōu)于現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)方法。

以上探討雖然大部分是針對(duì)維生素B12,但對(duì)于采用微生物法測定的其他水溶性維生素如葉酸等也同樣有效，可以借鑒。

參考文獻(xiàn)：

1) Margaret E. Gregory. The Microbiological Assay of ‘Vitamin B12’in the Milk of Different Animal Species.British Journal of Nutrition, 1954,8(04): 340

2）蔣孟虹、許蘋等. 微生物法測定腸內(nèi)營養(yǎng)粉劑中微量維生素B12 的含量.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào). 2016,7(3):893-897

3）張玉杰、呂為群.奶基嬰幼兒食品中維生素B12活性測定微生物分析法.生物技術(shù),1993(6):39-43

4）陳緒華、劉健、江一飛. 不同測定培養(yǎng)基對(duì)維生素B12線性的影響. 生物技術(shù)世界. 2013(4):47

5）林耀文、佘之蘊(yùn)，李姣等.微生物法測定含乳飲料中維生素B12含量. 飲料工業(yè).2013,16(4):39-42

6）吳環(huán)、劉冬虹、張慧、聶炎炎、黃宇峰.微生物法快速檢測食品中維生素B12含量的應(yīng)用研究.中國乳業(yè).2014,(4):42-44

7)王志偉、徐瓊、陳欣欽、曲勤鳳. 天然燕麥中維生素B12的測定中2種微生物法前處理方式的比較.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào), 2017,8(1):275-279

8）劉冬虹，吳環(huán)，聶炎炎，黃宇鋒. 優(yōu)化微生物法快速測定嬰幼兒配方乳粉中4種水溶性維生素.華南預(yù)防醫(yī)學(xué),2014(6):594-597