進(jìn)口支原體參比標(biāo)準(zhǔn)品及應(yīng)用

以PCR為代表的核酸擴(kuò)增技術(shù)（簡稱NAT）自1988年發(fā)明以來，已廣泛應(yīng)用于科研和臨床，但用于生物制藥則較晚，這是因為標(biāo)準(zhǔn)化的建立需要一定的時間。

我國藥典2020版《前言》指出：

要“緊跟國際前沿，不斷擴(kuò)大成熟檢測技術(shù)在藥品質(zhì)量控制中的推廣和應(yīng)用，檢測方法的靈敏度、專屬性、適用性和可靠性顯著提升，藥品質(zhì)量控制手段得到進(jìn)一步加強(qiáng)。如新增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 法、DNA 測序技術(shù)指導(dǎo)原則等，推進(jìn)分子生物學(xué)檢測技術(shù)在中藥飲片、動物組織來源材料、生物制品起始材料、微生物污染溯源鑒定中的應(yīng)用。”

在支原體檢查方面，藥典2020版在《通則3301 支原體檢查法》中也指出，

除了培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法），“也可采用經(jīng)國家藥品檢定機(jī)枸認(rèn)可的其他方法。”實(shí)際上這里的其他方法，就包括分子生物學(xué)方法（如NAT）。

2018年6月發(fā)布的《CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點(diǎn)》指出：

“由于藥典支原體檢查時間較長，因此也鼓勵研究者開發(fā)快速的支原體檢查法用于中間過程監(jiān)測或放行檢測，但在臨床試驗過程中必須對快速方法進(jìn)行充分的驗證，驗證方法可參考中國藥典的相關(guān)規(guī)定及國際要求，證明所用快速方法的最低檢出限至少不能低于藥典方法。即使選用商品化的檢測試劑，在使用前也需確認(rèn)其最低檢出限不低藥典方法。在早期使用時，應(yīng)與藥典方法平行進(jìn)行，在獲得充分的比對數(shù)據(jù)后才有可能替代藥典方法?！?nbsp;       即規(guī)定了建立支原體快速檢查方法的一般原則。

2018年8月，我國藥品監(jiān)管部門還在《支原體檢查的核酸檢測方法及方法學(xué)驗證的思考》一文（見《中國藥事》第 8期）中，討論了方法驗證和標(biāo)準(zhǔn)支原體菌株的應(yīng)用：

“開展支原體NAT方法學(xué)最低檢出限驗證需要2個關(guān)鍵元素的支持：

1）需要有正確鑒定的不同種類的支原體菌株，……；

2）這些菌株需要經(jīng)過標(biāo)化，即將支原體菌株制備分裝后，通過準(zhǔn)確的支原體菌落計數(shù)或基因拷貝數(shù)定量對驗證用的支原體菌株樣本進(jìn)行標(biāo)化。

目前，國際上有相關(guān)機(jī)構(gòu)可提供這樣標(biāo)定好的支原體菌株?！?/span>

就筆者所知，德國MB公司

（全稱Minerva Biolabs）即提供有這樣標(biāo)定好的支原體菌株和支原體基因組DNA（拷貝數(shù)已經(jīng)標(biāo)定）。

德國MB公司成立于1999年，總部位于德國柏林。

公司創(chuàng)始人來自于全球聞名的羅伯特?科赫微生物研究所。

MB公司自1999年起即研發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)和生物藥工業(yè)用QC檢測試劑。

他們配備有生物安全二級實(shí)驗室和GMP級潔凈車間生產(chǎn)車間，具有ISO 9001和ISO 13485認(rèn)證。

在國際上，歐洲藥典2007年版即提到支原體NAT法可替代藥典方法，但需要進(jìn)行驗證，并提到使用參比標(biāo)準(zhǔn)品。美國藥典和日本藥典也先后承認(rèn)可使用驗證后的NAT法。

事實(shí)上，德國MB公司提供的支原體PCR和qPCR經(jīng)典法試劑盒已經(jīng)過MB公司自己的全面驗證，如使用MB公司的試劑盒，只需要再做樣本基質(zhì)適用性的驗證。在驗證中，檢測限的驗證是主要內(nèi)容之一。

歐洲藥典指出，核酸擴(kuò)增法如替代藥典規(guī)定的培養(yǎng)法，其檢測限需達(dá)到10CFU/ml，如替代指示細(xì)胞培養(yǎng)法，檢測限需達(dá)到100CFU/ml。也可通過核酸拷貝數(shù)確定檢測限，但應(yīng)提前建立CFU與核酸拷貝數(shù)之間的換算關(guān)系。

德國MB公司即提供有標(biāo)定過的10CFU/管和100CFU/管的支原體菌株。

菌株均來自英國菌種保藏中心（NCTC），具有ATCC編號。

為避免給實(shí)驗室?guī)砦廴?，支原體已經(jīng)過滅活，并且為凍干粉形式，性能穩(wěn)定。

MB公司提供的支原體菌株有：

萊氏無膽甾原體（A. laidlawii）

發(fā)酵支原體（M.fermentans）

豬鼻支原體（M. hyorhinis）

口腔支原體（M. oral）

精氨酸支原體（M. arginini）

肺炎支原體（M. pneumonia）

雞毒支原體（M. gallisepticum）

滑液支原體（M. synoviae）

螺原體（Spiroplasma citri）

唾液支原體（M. salivarium）

每種支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品都提供有CFU與GC（基因組拷貝數(shù)）的換算數(shù)值（每個批次均不同，詳見質(zhì)控證書）。

表：MB公司提供的歐洲藥典要求檢測的10CFU?支原體滅活菌株

德國MB公司還提供有經(jīng)過精準(zhǔn)定量的支原體基因組DNA，

每管1×108拷貝數(shù)，梯度稀釋后可用于確定檢測限，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖. 肺炎支原體DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后的擴(kuò)增曲線。

DNA的量為2X105——2個拷貝。

MB公司還提供有用于特異性驗證的支原體基因組DNA以及細(xì)菌基因組DNA。

另需注意：按照國外藥典，支原體菌株和樣品需經(jīng)支原體DNA抽提后，才能進(jìn)行PCR檢測。因此，選擇合適的支原體DNA提取試劑盒也是需要考慮的因素。

事實(shí)上，我國藥典對標(biāo)準(zhǔn)品和參考品均有嚴(yán)格的界定。（見《中國藥典·生物制品國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備和標(biāo)定》）這里所說的參比標(biāo)準(zhǔn)品，系迻譯自歐洲藥典的叫法?；蚩煞Q之為支原體參比物質(zhì)樣本。

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