【系列2】胎牛血清RNA干擾了細(xì)胞培養(yǎng)外源性RNA

（e）基于主要的RNA的組合物的對(duì)數(shù)變換后的數(shù)據(jù)的皮爾遜聚類分析顯示來(lái)自三個(gè)粒料樣品三個(gè)上清液樣品分離（表示為S）（表示為P）。

（f）在最豐富的miRNA在FBS的沉淀和上清液的級(jí)分（24小時(shí)UC）通過(guò)RNA-SEQ所檢測(cè)。值得注意的是，的miR-451不從NEBNext小RNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

（g）FBS的沉淀和上清液中選擇的miRNA的水平通過(guò)qRT-PCR測(cè)定。每組n=3的FBS等分試樣。

（h）牛和靈長(zhǎng)類特異性的miR-1246是通過(guò)qRT-PCR在小鼠培養(yǎng)的細(xì)胞，但不小鼠組織檢測(cè)。N=3的細(xì)胞或每組組織切片。*P<0.05;**P<0.01;NS，不顯著。所有的棒表示平均±SEM所示。

RNA，不能從FBS的使用超速離心耗盡

我們接下來(lái)設(shè)置來(lái)表征FBS的RNA的組合物，并調(diào)查是否RNA可從血清中除去。血清的RNA與外來(lái)體和其他電動(dòng)汽車，以及非膜脂和蛋白質(zhì)的RNP相關(guān)聯(lián)。大多數(shù)研究人員使用70000克到110000克UC2小時(shí)，18小時(shí)，生產(chǎn)vdFBS。

已經(jīng)證實(shí)，長(zhǎng)時(shí)間的UC除去大部分，雖然不是所有的電動(dòng)車，如通過(guò)NanoSight監(jiān)測(cè)12。但是，什么延長(zhǎng)vdFBS是RNA耗盡尚不清楚。為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們紡絲FBS的樣品以100,000g為80分鐘，5小時(shí)，或24小時(shí)，并分離總RNA從沉淀（即EV-富集）材料和上清液（即EV-耗盡。RNA也從在基線粗FBS的隔離。5-40納克/毫升總RNA從粗FBS分離，鱗和批次間變化，并與人血清的以前的評(píng)估一致13。如圖所示。1c中，即使是長(zhǎng)時(shí)間的24小時(shí)的UC延伸超過(guò)報(bào)協(xié)議，僅除去從FBS（RNA的（19-33％）的一部分圖1c）。平均起來(lái)，vdFBS制劑含有34納克/毫升的RNA，其中大部分是最有可能與非囊泡復(fù)合物，如的RNP相關(guān)聯(lián)。無(wú)論該RNA（水泡與否）的源，它可以潛在地污染細(xì)胞培養(yǎng)物條件培養(yǎng)基和共分離物/沉淀用在隨后的程序在細(xì)胞培養(yǎng)的電動(dòng)汽車。

FBS包含人類和小鼠的成績(jī)單無(wú)法區(qū)分保守的RNA種類多樣的劇目

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)FBS RNA與衍生exRNA細(xì)胞培養(yǎng)干擾的潛力，我們進(jìn)行了FBS分?jǐn)?shù)RNA深度測(cè)序。FBS的三個(gè)不同批次100,000g下離心24小時(shí)，并從沉淀的EV-富集級(jí)分和EV-耗盡上清中分離的RNA樣品用于NEBNext小RNA文庫(kù)的構(gòu)建，隨后HiSeq2000RNA的起。閱讀映射人類基因組hg19版本使用摘錄Genboree工作臺(tái)的小RNA-SEQ管道V2.2.8使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行14。平均而言,13.6％和21.7％讀取來(lái)自“沉淀的RNA”和“上清液的RNA”的級(jí)分，分別映射到人類基因組，這表明FBS相關(guān)轉(zhuǎn)錄的顯著一部分進(jìn)化上保守的，并且可以有助于假陽(yáng)性人類細(xì)胞的分析。具有精確無(wú)失配**的映射允許，9.2％和各個(gè)級(jí)分的13.2％中讀取映射到人類基因組。兩個(gè)級(jí)分的主要的RNA的組合物，表示每百萬(wàn)映射（RPM），為讀出，示于圖1D。